糖酵解过程的发现是一个漫长的历史过程，经历了很多化学家和生物学家的不懈努力，其中起到关键作用的是以下几位生物学家。
首先是巴斯德，他提出了糖酵解最原始的概念。19世纪中叶由于法国微生物学家路易斯.巴斯德在科学界的名望，他的观点一直占据着统治地位。他认为发酵现象是由微生物引起的，发酵过程以及其它各种生物过程都离不开一种生命物质所固有的活力的作用，他称发酵为“不要空气的生命”。这种看法脱离了之前的唯心主义观点，并且他认为发酵是由微生物引起的观点是正确的。1857年，他发表了《关于乳酸发酵的记录》一文。这篇文章也被认为是研究发酵过程中最为经典的论文。巴斯德在发酵实验中发现了乳酸杆菌，他认为正是这种不起眼的微生物是促成发酵的关键因素。他的研究吹响了发酵研究的集结号，而糖酵解作为发酵现象中最重要的一种形式，无疑会受到后续研究者的重视。
巴斯德最后将自己的精力全部投入到发酵的工业应用上。因为第一次世界大战对法国的经济产生了致命的打击，巴斯德希望自己的科研成果能够尽快的转化成经济效益，于是他便放弃了纯粹的理论研究，更多的去关注发酵过程的应用问题，包括如何控制发酵时间和如何把握酿造质量等。
虽然巴斯德放弃了对发酵的学术研究，更多的去关注发酵在酿酒产业中的应用，但他依然被誉为糖类酵解研究的奠基人。
在巴斯德之后，对糖酵解发现做出实质性贡献的要数布赫那兄弟（Hans Buchner、Edward Buchner）。刚开始，他们的研究并不是针对发酵设计的，而是为了研究动物的消化条件，但是实验中一个偶然的发现改变了兄弟俩的研究计划，也加速了糖酵解的研究进程。
1897年，布赫那兄弟开始着手研究动物体内的消化情况，为了准备相关的实验材料，他们利用不含有细胞的酵母浸出液作为实验药物，加上细沙、矽藻土和酵母一起研磨，再用水力压榨机榨出汁液，来模仿动物体内的消化环境。为了不影响动物实验的结果，获得汁液后就必须进行防腐处理，而最方便的办法就是添加防腐剂。当时可以添加的防腐剂有很多种，唯一的条件就是不能在动物实验中产生其它的副产物，于是兄弟俩选择了日常常用的蔗糖，而这一不经意间的选择，也促成了兄弟俩的成功，预示着糖酵解过程逐步被揭开神秘的面纱。实验完成后，还剩余一些实验榨汁液，因为某些原因他们没有及时处理。时隔几天，他们却意外的发现这些酵母菌的榨汁液居然能引起蔗糖发酵，这是人类第一次发现在没有活酵母存在情况下的发酵现象。按照以往的观点，发酵现象发生的前提是具有完整结构的活细胞参与，而实验液体中蔗糖的发酵，是在酵母被研磨成碎片后取得的榨汁液的催化下发生的，这打破了之前科学界固有的观点——必须存在活体酵母的情况下才能够发生发酵反应。他俩把这种物质称为酿酶，从此拉开了研究没有活细胞参与的发酵的新纪元。
随后在这个领域上做出贡献的是英国生物学家哈登（Arthur Harden），他是英国皇家学会的院士，由于在糖酵解和发酵酶方面的研究荣获了1929年的诺贝尔化学奖。哈登1865年10月12日出生在英格兰的曼彻斯特，先后就读于维多利亚的私立学校和斯塔福德郡的Tettenhall学院，后来他辗转进入了曼彻斯特大学的欧文斯学院，师从罗斯教授从事化学研究。毕业后他获得了荣誉学位，并于1886年被授予道尔顿奖学金。
1887年是哈登学术思想发展最为迅速的一年，这一年哈登在埃朗根遇见了在此当教授的费歇尔，他们成为了同事，共同研究感兴趣的化学问题，这也是糖酵解发现过程中最重要的两位科学家在一起共事交流学术问题的黄金时间。当时费歇尔正在思考如何合成嘌呤和找寻各种单糖的结构，哈登致力于研究二氧化碳和氯的混合物在光照下如何发生反应的课题。受到费歇尔的影响，哈登也开始思考糖类酵解的相关问题。在1887年这一年中，两人对糖类研究的意见交换对后续研究产生的影响可能是极其深远的，这一年可以看成是糖酵解发现过程中起到催化提速作用的一年。费歇尔和哈登分别就糖类的结构问题、发酵后的反应去向、磷酸化的过程等问题详细做了探讨，由于有着相似的生物化学和有机化学研究背景，所以对糖类物质研究的观点和思路两人一拍即合。费歇尔建议哈登可以考虑磷酸化对糖酵解的影响，这对后来哈登发现糖酵解循环的前五步反应有着积极的作用。
哈登和费歇尔短暂的共事一年之后，于1888年来到伦敦学院，他的研究方向受费歇尔的影响发生了转变，开始发挥他在化学方面的特长，利用自己的化学背景去研究生物现象，其中主要是研究细菌在化学作用下的酒精发酵。他以葡萄糖的分解产物为切入点，试图找到酵母细胞发酵后的生成物是什么。他先后针对发酵的糖、酵母汁为实验对象研究其中的化学反应，去探索酵母汁作用下发酵的葡萄糖究竟能生成什么物质，但是由于反应的连续进行，提纯物质相对困难，这一实验未能达到预期的效果。
随后哈登回到曼彻斯特担任讲师并讲学，直到1897年被任命为新成立的英国化学家预防医学研究所，即后来的李斯特研究所的负责人。在1888年至1896年这近十年的时间里，他一直在进行酵解中磷酸化的研究，发现酵母细胞中的化学反应与糖酵解紧密相连。哈登和另一位生物化学家杨戈（W．J．Young）在实验室中发现了无机磷酸的作用，证明了磷酸盐是发酵过程中的关键物质，参与发酵过程中间产物的形成，缺少磷酸盐则发酵过程的第一步就无法进行。这一理论的提出使得对糖酵解的认识又近了一大步。
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